微生物降解苯酚污染的研究进展

许雅洁，张怡洋，3，刘 阳，薛林贵，章高森

（1.兰州交通大学生物与制药工程学院，兰州 730070；2.甘肃省极端环境微生物资源与工程重点实验室，兰州 730000；3.中国科学院西北生态环境资源研究院/沙漠与沙漠化重点实验室，兰州 730000；4.中国科学院西北生态环境资源研究院/冰冻圈科学国家重点实验室，兰州 730000；5.中国科学院大学，北京100049）

苯酚是一种具有强毒性且难去除的工业污染物，是从工业过程中排放出来的，如纺织加工、煤气化、炼油、皮革制造、树脂合成、香水生产等［1-5］。苯酚具有毒性、致突变性和致癌性，对环境有严重的破坏作用［6］。由于大规模的工业应用，苯酚不可避免地被引入水或土壤环境，造成水体和土壤污染，由于其毒性大，即使在低浓度下也可能构成严重的生态危害。苯酚及酚类化合物对水体的污染主要以焦化废水为主（焦化废水是指化工类企业在工业加工过程中产生的高毒性、高污染废水），其主要来源于生产煤和汽油的企业，以及加工液化气、运输制冷等过程。同时化工厂附近的土壤也会受到一定程度的污染，进而污染农作物及其制作的食品，最终危害人类健康。苯酚不仅在环境中具有明显的累积效应，而且容易与其他有机化合物共存形成新的复合污染物，或在水中发生取代或其他化学反应转化为比苯酚毒性更高的酚类化合物，如氯酚、甲基酚和烷基酚等，而且在生物体内难以分解。酚类化合物的毒性随结构和官能团的不同而变化，这些物质的顽固性和持久性更大，增加了对苯酚污染治理的难度，间接增加了对人体的危害程度［7，8］。

苯酚作为重要的有机化工原料和工业商品，生产的相关下游产品涉及人们生活的很多方面，如可生产作为汽车外壳涂料的双酚A 以及生产为水杨酸［7］。此外，苯酚还可用作溶剂、试验试剂和消毒剂等，如作为具有杀菌特性的乳膏和剃须皂，或被用作内部防腐剂和胃麻醉剂。因此，苯酚在染料、制药、化肥、塑料、玻璃纤维、食品工业和石化等各种行业都有应用［9，10］。2019 年，全球苯酚需求量约为1 200 万t，预计未来需求量还会增加。随着中国经济的飞速发展，国内产业对苯酚的需求也在不断上升，2016—2021 年中国苯酚消费量呈稳步增长态势，2021 年中国苯酚表观消费量为367.3 万t，依据往年增长速率预计2023 年中国苯酚表观消费量将达到400 万t 以上［11，12］。因此，苯酚污染问题将一直存在，并越来越受到人们的重视，如何绿色高效地解决苯酚污染问题变得非常迫切。

处理含酚废水的常见物理、化学方法有臭氧氧化、芬顿反应、紫外辐照和过氧化氢处理等，但这些方法成本高、对环境有害，且不适用于大量废水［13，14］。与物理化学方法相比，生物修复法具有经济可行性、环境友好性和实际可操作性等优点，更具应用前景［15-17］。本研究从细菌、真菌、微藻降解苯酚污染的研究进展、降解机制、影响因素以及降解技术优化等方面进行探讨，为探索出绿色、高效解决苯酚污染的方法提供参考和依据。

1 微生物降解苯酚代谢机制

由于苯酚结构复杂，作为有毒有害的外源物质很难分解，然而，微生物能够利用这些外源性物质进行生长［18］。微生物可以产生多种酶并代谢这些有害和有毒物质。苯酚降解菌对苯酚的降解分为好氧降解和厌氧降解2 种，大多数情况下为好氧降解且苯酚降解菌的好氧代谢途径较为复杂。苯酚降解过程中使用的酶包括水解酶、邻苯二酚双加氧酶、顺式粘糠酸内酯酶等［10］。国内外的研究者进行了大量试验来分离和培养具有高苯酚降解活性的微生物。

细菌中苯酚有氧代谢路径主要研究的是羟基化途径：苯酚羟化酶（E1）将苯酚（Phenol）转化为邻苯二酚（Catechol），这是细菌中好氧分解代谢苯酚的第一步。邻苯二酚是细菌中各种芳香族化合物有氧分解代谢的外围途径的重要中间产物［19］。邻苯二酚通过芳香环在2 个不同方向上的断裂而被氧化［20-22］，因此氧化途径分为2 种［23］。①在邻苯二酚1，2-双加氧酶（E2）催化下进行邻位开环途径，生成顺，顺-粘康酸，之后转化为β-酮己二酸，通过β-酮己二酸途径转化为三羧酸循环的中间物质琥珀酸与乙酰辅酶A，最后进入三羧酸循环完成苯酚的代谢，提供生物体生长繁殖所需的物质和能量。②在邻苯二酚2，3-双加氧酶（E3）催化下间位开环途径生成2-羟基粘糠半醛，进而在多种酶的催化作用下逐步转化为4-羟基-α-酮基戊酸，最终转化为乙酸和丙酮酸，进入三羧酸循环［24，25］，实现苯酚的完全降解（图1）。

图1 微生物好氧降解苯酚途径

2 微生物降解苯酚的研究进展

2.1 细菌降解苯酚

国内外研究者分离了大量苯酚降解细菌，对已报道的苯酚降解细菌的种属及名称、分离源、对苯酚的降解能力及降解时间进行了归纳分析。降解苯酚的细菌多数分离自焦化废水以及活性污泥等苯酚污染严重的场所。经过鉴定这些苯酚降解菌大多数为变形菌门的假单胞菌属、不动杆菌属，厚壁菌门的芽孢杆菌属，放线菌门的红球菌属以及节杆菌属。细菌对苯酚的降解浓度最高可达3 000 mg/L，但实现降解率为100%时，苯酚浓度一般不高于1 800 mg/L（表1）。

除了单一细菌对苯酚的降解，多种细菌协同作用降解苯酚的研究也较多。Li 等［71］研究了Stenotrophomonassp.N5 和Advenellasp.B9（9∶1）共培养对苯酚降解产生的协同机制，2 个菌株之间的相互作用降低了苯酚引起的抑制作用，与单菌株比较降解能力增强，在72 h内可完全降解高达1 200 mg/L的苯酚。

联合菌群MR-01 是从石油污染的土壤中分离出来的，能够在8 d 后降解59%的原油成分，130 d 后降解34%的燃油成分［72］。这些底物的存在改变了联合菌群的代谢功能，影响了种群结构，产生了物种分化。联合体中的结构和代谢的修饰改变是重要的生存策略，在降解不同环境污染物方面具有优势。因此，将MR-01 在亚致死浓度的苯酚（874 mg/L）中适应90 d 后，驯化的MR-01 培养物在含有不同浓度苯酚（94、282、459、686、874 mg/L）的培养基中生长。结果表明，随着苯酚初始浓度的增加，苯酚降解量增加；最终MR-01 在874 mg/L 的苯酚浓度下48 h 后达到最大降解率87%［73］。

2.2 真菌降解苯酚

在苯酚降解菌中，真菌约占25%，其中以酵母菌为主［74］。如从污水处理厂曝气池中分离得到1 株苯酚降解真菌GY8，鉴定为假丝酵母菌属（Candidasp.）。该菌株72 h 内可以完全降解初始浓度为1 g/L 的苯酚，并且在以苯酚为惟一碳源的培养条件下苯酚耐受浓度最高可达1.8 g/L［75］。丁杰等［76］从含酚废水处理池污泥中驯化出假丝酵母菌FD-1，可以在30 h内将1 500 mg/L 浓度的苯酚完全降解。此外，苯酚降解真菌也具有一定的耐盐性，从连云港海岸带淤泥分离得到1 株耐盐苯酚降解菌株Candida tropicalisSDP-1，最大能够耐受12%（m/V，下同）的NaCl，24 h 内可完全降解1 200 mg/L 的苯酚［77］。Xie 等［78］研究了假丝酵母菌LN1 在高浓度苯酚作用下的形态、生理变化，结果证实LN1 在6 000 mg/L 苯酚浓度下培养14 h 后进入VBNC 状态，该菌株具有高效降解1 000 mg/L 苯酚的能力以及很高的芳香化合物降解潜力。

除假丝酵母菌属外，研究者也筛选出其他对苯酚具有降解作用的真菌。Karimi 等［79］从焦化厂的环境样品（土壤和废水）中分离出多株苯酚降解真菌，选择生长速率较快的4 株真菌（K1、K2、K7 和K11）进行研究，其中K2 为Pichia guilliermondii，K7为Meyerozyma guilliermondii。白腐真菌是一类能引起木材白色腐烂的真菌总称。白腐真菌最初只用于木材的降解，后发现白腐真菌能够降解多种有机污染物，在环境领域具有重要的应用价值，因此成为研究热点［80］。朱泽军等［81］重点研究了白腐真菌降解苯酚的机制是白腐真菌通过醌氧化还原循环产生·OH，并通过·OH 的氧化作用攻击底物，这有可能是白腐真菌降解苯酚的机制。

2.3 微藻降解苯酚

微藻已被应用于处理多种废水，微藻可以将水氧化，从而降低污染废水的生化需氧量（BOD），可以吸收营养物质，从而防止下游水生系统的富营养化，可以改变水体pH，这有助于灭活病原体［82］。此外，与细菌不同的是藻类使用二氧化碳作为碳源，因此不需要在废水中添加额外的碳源。一般来说，使用藻类的污染处理主要用于去除营养物质，如城市污水中的氮和磷。由于发现微藻具有去除重金属和持久性有机污染物（POPs）的潜力，所以研究者对微藻降解苯酚的能力进行了研究。

藻类的苯酚去除能力主要取决于污染物基质类型、反应时间、处理水体的pH 和光照。与其他微生物相比，单一微藻对苯酚的降解容易受到光照条件的限制［83］，且处理时间较长以及易被不同酚类化合物的毒性影响，即使在低浓度下，剧毒酚类化合物也可能阻碍微藻的生长。因此，学者们把研究重点放在微藻与其他微生物联合降解苯酚的效果上。

藻类与细菌具有共生关系，在降解苯酚的过程中可以相互协同作用，使降解过程稳定不易受到环境的影响。Eio 等［84］尝试在藻类-细菌系统中降解双酚，研究观察到小球藻（Chlorella sorokiniana）的单一藻类培养可去除约50%的双酚，但在任意初始双酚浓度下藻类-细菌系统均可以将双酚完全降解；此外，观察到当双酚浓度超过20 mg/L 时会抑制单一藻类培养中小球藻的生长，而在藻类-细菌系统中没有观察到这种抑制现象。Yi 等［85］人工建立了1个小球藻（Chlorellasp.）与Cupriavidus necator的微生态环境，用于降解苯酚；初步证明了小球藻和C.necator之间的协同作用，然后系统评估和优化了小球藻与C.necator的接种比例、光照度、温度和pH 对该微生态系统性能的影响。在最佳条件下，该系统可以在60 h 内降解1 200 mg/L 的苯酚。

3 影响微生物降解苯酚的因素

生物降解受物理、化学和生物条件的影响，从而影响苯酚的整体降解效率。研究比较多的影响微生物降解苯酚效率的因素主要包括苯酚浓度、温度、pH、盐度以及附加碳源和氮源这5 个方面。

1）苯酚浓度。一般来说，苯酚对生物体有毒。一些苯酚降解菌可以利用低浓度的苯酚作为碳源，但随着苯酚浓度的提高，其生物毒性也随之增加，菌株的生长和降解能力逐渐受到抑制。不同细菌对苯酚的耐受性和降解能力不同，在100～1 500 mg/L 的苯酚浓度范围内，可以高效降解苯酚的细菌较为丰富。其中，Rhodococcussp.和Oceanimonassp.被认为是较有效的苯酚降解细菌，可代谢高达1 500 mg/L的苯酚浓度［26，86］。

2）温度。温度与底物的生物利用率和溶解度以及微生物降解的特性和代谢率有关［87-89］。因此，需筛选出最佳温度，以使生物降解过程中的关键酶发挥主导作用。大多数细菌生物降解的适宜温度范围为25～37 ℃，较高或较低的温度可能会对负责芳香环裂解的酶产生不利影响［90，91］。

3）pH。pH 在6.0～8.0 时适用于大多数苯酚降解细菌菌株，pH 的变化会影响微生物的生长以及酶活性［92，93］。如邻苯二酚2，3-双加氧酶的最佳pH 为8.0［94，95］。

4）盐度。一些降解苯酚的微生物是中度嗜盐或轻度嗜盐细菌，Alva 等［96］研究发现，在Halomonas campisalis降解苯酚过程中较高的盐度对顺，顺-粘糠酸的积累影响有限，但只有在无NaCl 的条件下，顺，顺-粘糠酸才能被完全降解。因此，盐度会在一定程度上影响苯酚的代谢途径。在已报道的嗜盐苯酚降解菌中，嗜盐单胞菌属（Halomonassp.）是研究较多的一类，其能在5%～10%的高盐环境中生长繁殖，可有效降解1 100 mg/L 的苯酚［97］。

5）附加碳源和氮源。异养微生物可以利用苯酚等有机污染物作为碳源，但为了更好地生长和繁殖，它们还需要额外的、自身无法合成的营养物质，如葡萄糖、淀粉、蛋白胨、酵母或尿素等。细菌优先利用易于降解的碳源和氮源，加快生长和繁殖的速度，从而提高对底物的降解速度。Veenagayathri 等［98］证明，使用酵母膏作为外加氮源使耐盐细菌联合体在降解苯酚方面更有效。Chandrasekaran 等［99］研究发现，在盐浓度为12%时，添加酵母提取物显著增强了苯酚降解效率，添加尿素减少了苯酚生物降解的滞后时间。

除以上5 种影响因素外，影响微生物降解苯酚效率的因素还有很多，如复苏促进因子（Rpf）、微量金属元素的特殊添加剂以及微生物的接种量，除了碳和氮源，微生物还受到磷、硫、镁、钾等其他无机营养物质的调控［100］，可以针对不同地区筛选得到菌种的实际情况探究通过改变影响因素，从而提高降解效率的方法。

4 微生物降解苯酚技术优化及应用的研究进展

4.1 细胞固定技术

在有机物的生物降解中，使用固定化细胞已被证明比自由悬浮细胞的传统生物系统更有效。固定化的优势在于可通过更高的细胞负载提高生物降解率，保护微生物免受恶劣环境条件的影响，允许更高的生物量密度，提供再利用和回收机会［101-103］。通过固定化处理的微生物可以快速适应污染环境，并提高其降解苯酚的性能。

微生物经固定化处理后可以适应更高盐度的苯酚污染废水，如Tan 等［86］采用海洋单胞菌（Oceanimonassp.）经过细胞固定化处理后可降解苯酚浓度为1.5 g/L、NaCl 浓度为6%的含酚废水，降解率可达99%。Jiang 等［17］利用磁性固定Comamonassp.细胞与电极耦合的集成系统来处理含酚废水。结果表明，在盐度5%的情况下，1 000 mg/L 的苯酚完全降解。细胞固定技术还能提高菌体存活率和储藏稳定性，张安龙等［104］分离筛选得到1 株高效降解苯酚真菌QWD1并以谷糠为载体制备固体菌剂。通过鉴定该真菌为Magnusiomyces capitatus，28 d 内对1 600 mg/L苯酚降解率为97.15%，制成菌剂后保存时间可达90 d 甚至更长，活菌数高达2.5×108CFU/g 左右，降解苯酚效果良好。

固定化小球可以有效地多次重复使用［105］，再利用是细胞固定技术在实际应用中的主要优势。此外，苯酚在水中排放后会沉淀到底部，并在其中不断溶解。传统的非固定化生物方法只能处理地表水中的污染物，而固定化技术有望通过在水下使用固定化细菌来处理更深水域的苯酚污染。

4.2 生物反应器系统

在各种反应器应用中，已有许多关于通过微生物降解去除苯酚的研究［106-109］。在多种工业废水中可溶无机盐与酚类化合物同时存在，据估计5%的工业废水是含盐或高盐废水［110］，然而微生物的代谢活性在高盐废水中受到抑制［111-113］。因此，在高盐度条件下处理含酚废水比较困难，研究者通过利用苯酚降解菌构建生物反应器系统的方法来克服高盐度的影响。

在含盐或高盐条件下用苯酚生物降解废水处理的好氧反应器系统中，序批式反应器（SBR）在含盐条件下去除苯酚是常用的方法。SBR 在含盐条件下能有效去除高浓度苯酚［114-116］。此外，由于电化学过程和生物降解之间存在耦合效应，电辅助SBR 对含盐废水中的苯酚也表现出良好的去除效果，同时生物电化学方法也减轻了盐胁迫对细菌群落的影响［117-119］。

膜式生物反应器（MBR）也是处理含酚含盐废水的常用方法。MBR 是包含生物降解和物理过滤单元的复合系统，其优点包括出水水质高、产生污泥量少、降解污染物的能力强等［120］。Juang 等［121］在微孔聚丙烯（PP）中空纤维膜接触器的生物反应器中使用假单胞菌（Pseudomonas putida）BCRC14365 降解含苯酚废水，悬浮细胞在100 mg/L 苯酚下生长，且仅在浓度0.44 mol/L 以下的NaCl 溶液中生长；然而在膜式生物反应器中，纤维膜中的细胞可在NaCl 浓度为1.52 mol/L 时完全分解500 mg/L 的苯酚，这是因为附着生物膜提高了其对盐浓度的耐受极限。MBR 在耐盐性和苯酚去除性能方面表现较强，在6%的盐浓度下，它可以完全降解1 500 mg/L 的苯酚［66］，但膜孔可能被EPS（胞外聚合物）或SMP（可溶性微生物产物）堵塞；同时高盐度可能会改变膜的渗透性，增加膜生物污染率，从而影响修复能力［122，123］。

尽管有很多相关报道，但大多数方法都是将合成废水作为进水，而不是实际的含酚含盐污水。这些工艺需要在实际条件下不断测试，以处理不同成分和盐浓度的各种含酚废水。

5 展望

具有苯酚高降解性能的细菌、真菌以及微藻被筛选培育出来，这些研究丰富了苯酚降解菌的种类，为今后的研究提供了参考，但大数研究处于实验室阶段，真正投入实际应用的案例较少。由于苯酚的主要污染形式焦化废水是十分复杂的混合体系，用单一的细菌、真菌或微藻进行处理较难达到国家排放标准，并且降解过程对环境条件敏感，容易受外界刺激的不利影响导致修复效果减弱。通过微生物降解苯酚仍是较为经济有效的修复污染途径，因此未来的研究方向可以持续从苯酚污染环境或其他极端环境中分离、筛选、培育更多的高效苯酚降解细菌、真菌及微藻，在研究其基本降解特性后，深入探究多株苯酚降解菌协同修复或构建细菌-微藻系统，对已有苯酚降解菌株进行细胞固定化处理或建立生物反应器系统克服以上问题。随着科学技术的不断快速发展，新的现代化技术手段逐渐被运用到高效菌株培育中，如利用细胞融合技术处理菌株、生化技术培养菌株等，未来可以尝试应用于处理已发现的苯酚降解菌，以达到提高菌株的降解能力以及对环境的抵抗能力的目的。